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嘉安健達(dá)醫(yī)學(xué)科技(上海)有限公司是成立于上海的一家生物領(lǐng)域戰(zhàn)略性新型科技企業(yè),逐步組建高標(biāo)準(zhǔn)的二代測(cè)序中心、臨床檢測(cè)平臺(tái),在此基礎(chǔ)上建立醫(yī)學(xué)科研、轉(zhuǎn)化與應(yīng)用平臺(tái),致力于NGS技術(shù)、PCR技術(shù)等研發(fā)及臨床產(chǎn)業(yè)化。嘉安健達(dá)在生物醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)、生物信息學(xué)算法開發(fā)等領(lǐng)域深耕多年,擁有強(qiáng)大的知識(shí)體系與實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)。

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2024-12-23 03:10:07

一代、二代、三代測(cè)序的區(qū)別分別是什么?

一代測(cè)序是上世紀(jì)70年代由Sanger和Coulson開創(chuàng)的DNA雙脫氧鏈終止法測(cè)序,也稱為Sanger測(cè)序。

二代測(cè)序技術(shù)(NGS)是為了改進(jìn)一代測(cè)序通量過低的問題而出現(xiàn)的,能夠同時(shí)對(duì)上百萬甚至數(shù)十億個(gè)DNA分子進(jìn)行測(cè)序?qū)崿F(xiàn)了大規(guī)模、高通量測(cè)序的目標(biāo)。

三代測(cè)序主要有兩種技術(shù)PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore 的納米孔單分子測(cè)序技術(shù),這兩種技術(shù)的測(cè)序讀長(zhǎng)都可以達(dá)到幾-kb的級(jí)別,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于二代測(cè)序技術(shù)。 二代測(cè)序的原理是什么?上海二代測(cè)序應(yīng)用

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二代測(cè)序——轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的實(shí)驗(yàn)流程(上)

樣本采集和 RNA 提取

樣本采集需要考慮研究目的和樣本類型。例如,研究**組織的轉(zhuǎn)錄組,就要準(zhǔn)確獲取**組織樣本,同時(shí)比較好有對(duì)應(yīng)的正常組織作為對(duì)照。RNA 提取方法有多種,常用的如 Trizol 法,它可以有效地從細(xì)胞或組織中提取總 RNA,包括 mRNA、rRNA 和 tRNA 等。提取后的 RNA 質(zhì)量至關(guān)重要,需要通過瓊脂糖凝膠電泳或?qū)iT的 RNA 質(zhì)量檢測(cè)儀器來評(píng)估 RNA 的完整性和純度。

RNA 質(zhì)量檢測(cè)和定量

完整性方面,通常使用 RNA 完整性指數(shù)(RIN)來衡量。RIN 值越高(一般認(rèn)為 RIN > 7 是高質(zhì)量 RNA),說明 RNA 完整性越好。定量方法主要有紫外分光光度法和熒光定量法。紫外分光光度法可以通過測(cè)量 RNA 在 260nm 和 280nm 處的吸光度比值來估計(jì) RNA 純度,比值在 1.8 - 2.0 之間表示純度較好。熒光定量法則是使用專門的熒光染料(如 Qubit)來更準(zhǔn)確地測(cè)量 RNA 濃度。

文庫構(gòu)建

首先要進(jìn)行mRNA富集,一般使用帶有poly-T的磁珠來特異性地捕獲mRNA,因?yàn)檎婧松飉RNA的3'端都有poly-A尾巴。然后將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,再通過超聲或酶切等方法將cDNA片段化,片段大小通常在幾百個(gè)堿基對(duì)左右。之后在片段兩端連接上測(cè)序接頭,經(jīng)過PCR擴(kuò)增來增加文庫的量,使其達(dá)到可以上機(jī)測(cè)序的要求。


北京哪里有二代測(cè)序應(yīng)用二代測(cè)序是先打斷DNA,使其片段化。

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對(duì)于二代測(cè)序的概念是什么?

第二代測(cè)序(Next-generationsequencing,NGS)又稱為高通量測(cè)序(High-throughputsequencing),是基于PCR和基因芯片發(fā)展而來的DNA測(cè)序技術(shù)。我們都知道一代測(cè)序?yàn)楹铣山K止測(cè)序,而二代測(cè)序開創(chuàng)性的引入了可逆終止末端,從而實(shí)現(xiàn)邊合成邊測(cè)序(SequencingbySynthesis)。二代測(cè)序在DNA復(fù)制過程中通過捕捉新添加的堿基所攜帶的特殊標(biāo)記(一般為熒光分子標(biāo)記)來確定DNA的序列,現(xiàn)有的技術(shù)平臺(tái)主要包括Roche的454FLX、lllumina的Miseq/Hiseg等。2005年,羅氏推出了二代測(cè)序儀羅氏454,生命科學(xué)開始進(jìn)入高通量測(cè)序時(shí)代。2006年,隨著Ilumina系列測(cè)序平臺(tái)的推出,極大降低了二代測(cè)序的價(jià)格,推動(dòng)了高通量測(cè)序在生命科學(xué)各個(gè)研究領(lǐng)域的普及。

二代測(cè)序的操作流程有哪些?

1.DNA提取與質(zhì)檢

· 純凈、足量、質(zhì)量好的樣本DNA是檢測(cè)成功的基礎(chǔ)(可以來源于血漿、新鮮組織等)

2.DNA處理→文庫構(gòu)建

· 得到統(tǒng)一長(zhǎng)度區(qū)間+有接頭的DNA片段

· 步驟:DNA打斷→末端修復(fù)→片段篩選→加A尾→接頭連接→PCR

3.靶向捕獲

· 特定區(qū)域基因的定向檢測(cè)

4.上機(jī)測(cè)序

· 根據(jù)通量情況選擇測(cè)序儀

· 上樣后機(jī)器完成

5.數(shù)據(jù)分析

· 初級(jí)分析:光強(qiáng)數(shù)據(jù)(不同熒光標(biāo)記堿基)→序列信息(AGCT)

· 二級(jí)分析 多儀器自帶

· 三級(jí)分析 vcf文件 可diy 二代測(cè)序是一種能夠同時(shí)對(duì)數(shù)百萬甚至數(shù)十個(gè)億DNA片段進(jìn)行測(cè)序的方法。

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二代測(cè)序—全外顯子測(cè)序的局限性

不能檢測(cè)所有的遺傳變異:它只能檢測(cè)外顯子區(qū)域的變異,對(duì)于非外顯子區(qū)域(如內(nèi)含子、基因間區(qū)域)的變異無法檢測(cè),而這些區(qū)域的某些變異也可能對(duì)基因的表達(dá)和功能產(chǎn)生重要影響,如內(nèi)含子中的突變可能影響基因的剪接。

數(shù)據(jù)分析復(fù)雜:全外顯子測(cè)序會(huì)產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù),需要復(fù)雜的生物信息學(xué)工具和方法來進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。包括數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制、變異的檢測(cè)和注釋、致病性的評(píng)估等多個(gè)環(huán)節(jié),其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論。 高通量測(cè)序是二代測(cè)序嗎?上海嘉安健達(dá)二代測(cè)序提供

二代測(cè)序的流程有哪些?上海二代測(cè)序應(yīng)用

什么樣本可以做二代測(cè)序?④

4、口腔樣本

口腔拭子:通過刮取口腔黏膜細(xì)胞來獲取樣本??谇皇米硬杉奖?、無創(chuàng),可用于DNA提取和基因檢測(cè)。例如,在法醫(yī)鑒定中,口腔拭子是常用的樣本來源,用于個(gè)體身份識(shí)別和親子關(guān)系鑒定等;在一些大規(guī)模的人群基因篩查項(xiàng)目中,也可以使用口腔拭子來收集樣本。

5、糞便樣本

糞便中含有腸道微生物、腸道上皮細(xì)胞等成分。對(duì)糞便樣本進(jìn)行宏基因組測(cè)序,可以研究腸道微生物群落的組成、功能和多樣性。例如,在腸道疾?。ㄈ缪装Y性腸病、結(jié)直腸*等)的研究中,分析糞便中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化,以及微生物基因的表達(dá)情況,有助于了解疾病的發(fā)病機(jī)制和尋找潛在的生物標(biāo)志物。 上海二代測(cè)序應(yīng)用

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